采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理:
(1)蛋白质可作定量分析的原因:蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,所以蛋白质溶液在275 280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。
在一定浓度范围内,蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比,服从朗伯-比耳定律,因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。
(2)此种方法测量的准确度差一点的原因:由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同,所处的微环境也不同,所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。
据初步统计,浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间,平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。
核酸对紫外光的最大吸收凤位于260nm处,而蛋白质位于280nm处,260nm的吸收仅为核酸的1/10,因此蛋白质含量较底时对实验影响不大当样品中蛋白质含量较高时,将样品移至试管中,加入一定量稀盐溶液,用玻璃棒小心搅拌,使蛋白质沉淀。
滴加少量25%SDS溶液,边加边轻轻搅拌。加毕,在60℃水浴中保温10分钟,并不停轻轻搅拌,取出冷至室温,过滤可除去蛋白质。