总黄酮采用芦丁为标准品即可测定,单体黄酮需要对应的标准品。
黄酮含量的测定方法:
1、 对照法
1)
① 对照品制备:精密称取芦丁对照品20.8mg,置于100ml容量瓶中,加70%乙醇使溶解并稀释至刻度,摇匀。
② 样品溶液制备
精密称取样品0.50g,精密加入70%乙醇50ml,称定重量,超声处理30分钟,称定重量,用70%乙醇补足减失重量,即得。
③ 标准曲线的制备
精密称取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,分别置于25ml比色管中,加70%乙醇10ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加1mol/L氢氧化钠溶液10ml,加70%乙醇置刻度,摇匀,放置15分钟。各取10ml置于50ml容量瓶中,用70%乙醇稀释至刻度。在510nm的波长下测定吸光度。
2)
①样品溶液的制备:
分别精确称取80℃恒温干燥的样品用50%甲醇回流提取,料液比1:15,提取两次,每次30min,将两次提取液合并浓缩至一定体积,用30%甲醇定容至50ml容量瓶中。从其中取出12ml溶液放入100ml容量瓶中,稀释至刻度,再从100ml容量瓶中取出1.5ml溶液,放至10ml容量瓶中,定容,为待测样品液Ⅰa和Ⅱa。 ②最大吸收波长的选择:分别作样品液Ⅰa、Ⅱa及芦丁标准品的吸收曲线,均在350 nm 处有一强吸收,因此选择350 nm为测定波长。
③标准曲线的制定:
精密称取芦丁对照品10.3mg,用少量30%乙醇溶解后,转移至50ml容量瓶,用蒸馏水定容至刻度。分别精密量取2ml、3ml、4ml、5ml、6ml芦丁溶液置于100ml容量瓶中,于350 nm 波长处测定吸光值,以芦丁空白为参比,以芦丁浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线,提示在4.12~12.36mg/103ml浓度之间,吸光度值与浓度呈现良好的线性关系。
④含量测定结果:
分别吸取2.2.1中Ⅰa和Ⅱa待测样品液各适量于石英比色池中,按标准芦丁一吸光度测定法,以样液空白参比,于350nm 波长下测定吸光值,计算各提取液中总黄酮含量。
计算公式为:样品总黄酮含量(%)=0.03692(A+0.1644)/W。
注:上式为通过回归方程转化而来,式中A为测得样品液的吸光度值,W为称样量。