1、底物浓度：除选择适合的底物外，在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于［S］与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求［S］达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。
2、酶浓度：在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有［S］>>［E］时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。
3、温度：不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37～40℃。高于或低于最适温度，酶活性都降低。
4、离子强度和pH值：在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低。
一般采用电化学和光物理的方法
即利用反应物或产物的吸光性，用紫外分光光度法或荧光法测定。若酶反应过程中产物或反应物有气体，则可用测压仪(瓦氏呼吸仪)测定。若反应过程中生成酸，则可用电化学法。用同位素标记的底物则可用放射化学法测定底物浓度变化，计算酶活性。一些性质稳定的酶，也可用高效液相色谱法检测。
