[a]多糖含有几百个或更多残基,但只有一个还原基团,因此它的还原能力极弱,对于他们的测定,应先将它们用酸水解成单糖组分。
蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法,糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物,该衍生物与蒽酮发生反应,反应后溶液呈蓝绿色,于620nm处有最大吸收。因此可用此方法测定多糖含量。
[b]试剂
2g/L蒽酮试剂:溶解2g蒽酮于1L浓硫酸(98%的浓硫酸)中,当日配制使用。
0.01g/L葡萄糖溶液(可加几滴甲苯作防腐剂)
0.1g/L糖元溶液
[c]实验器材
试管及试管架 吸量管(1ml,5ml) 恒温水浴箱(100℃) 制冰机 紫外分光光度计 滴管 白瓷板
制作标准曲线
准确称取0.1g葡萄糖(分析纯),溶解并用蒸馏水定容至100ml后,分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中,并用蒸馏水定容到50ml,配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中,再加入3ml的蒽酮试剂,迅速浸入冰水中冷却,待几支试管均匀加完后,一起浸入100℃恒温水浴箱中,为防止水分蒸发,应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子,自温度重新升至100℃起计时,准确保温10min后取出,用流动水冷却,然后,于室温中平衡片刻(约10min左右),在分光光度计上,波长620nm处,用0.5cm厚度的比色杯,以空白管做对照空白(此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂,其他反应条件都一致),进行比色。
既得标准曲线。
如下表格 编号123456体积ml1(蒸馏水)11111浓度ug/ml020406080100 [d]样品测定
如上述条件一致,但要记得用除去蛋白质的样品溶液进行测定,否则会影响测定结果。
样品含糖量计算:
C×V2×D
样品含糖量(%)=----------------------×100%
W×V1×10
其中C----在标准曲线上查出的糖含量(ug),
V2---提取液总体积(ml)
V1---测定时取用体积(ml)
D-----稀释倍数
W-----样品重量(g)
10-----样品重量单位g换算成ug的倍数
注意事项:
1.一定要注意温度要控制在100℃
2.从100℃开始准确计时10min,然后迅速冷却,于室温中平衡10min.
3.蒽酮要注意避光保存。配置好的蒽酮试剂也应注意避光,当天配制好的当天使用。
4.试管要保证干燥清洁,无残留水滴。