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SODPOD活性的测定方法

有货之家 有货之家 发表于2024-11-14 03:24:12 浏览916 评论0

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POD过氧化物酶活性(参考Chance等[11]的方法)

SODPOD活性的测定方法

A. 酶液制备0.25g芽(剥除鳞片),加入0.0lg PVP, 5mL 0.lmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8,含有0.2mmo1/L EDTA, 0.4mmo1/L β-巯基乙醇)冰浴研磨,低温(4℃).12000r/min离心10min后,所得上清液为待测液。

B. POD溶液制备:在50mL 100mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液中加入19uL愈创木酚,加热搅拌,溶解冷却后加入28uL 30%的H2O2即为POD反应液,放到冰箱保存。

POD测定:酶液稀释10倍,取50uL待测液与2mL POD反应液和1mL 0.2mo1/L的磷酸二氢钾溶液反应,用紫外分光光度计于470nm处每隔30sec测其吸光值A470,重复3次求平均值,以△A470/min/gFW表示酶活大小。

SOD(超氧化物歧化酶活性)的测定

试剂:

① 0.05mol/l磷酸缓冲液(PH值为7.8)。

②提取介质:50mmol/l PH值为7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮)。

③130 mmol/l甲硫氨酸(Met)溶液:称1.3991g Met,用磷酸缓冲溶液溶解并定容至100ml。

④750umol/l NBT:称取0.06133gNBT,用磷酸缓冲溶液溶解并定容至100ml,避光保存。

⑤200umol/l核黄素溶液:遮光保存,随用随配。

参照王晶英等[82]的NBT还原法测定。取芽(剥除鳞片)0.25 g于预冷的研钵中,加2 mL预冷的提取介质。在冰浴下研磨成匀浆,加入提取介质冲洗研钵,并使终体积为5 mL,4℃下1000rpm离心15 min,上清液即为SOD粗提液。离心后取上清50 μL,加入1.5 mL磷酸缓冲液(0.05 mo/L),0.3 mL甲硫氨酸溶液(130 mmol/L),0.3 mL NBT溶液(750 μmol/L),0.3 mL EDTA-Na2溶液(100 μmol/L),30μL核黄素溶液(200 μmol/L),蒸馏水520 μL。两个对照以缓冲液代替酶液,给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光,与其他各管同时置于4000 lx日光灯下反应30 min。反应结束后,用黑布罩盖上试管,终止反应。以遮光的对照管作为空白,分别在560 nm波长下测定各管的吸光度,计算SOD活性。

SOD活性(μ/g)=(A0-As) ×Vt /(A0×0.5×m×Vs)

A0:照光对照光管的光吸收值

As:样品管的光吸收值

Vt:样液总体积(mL)

Vs:测定时样品用量(mL)

m:样品鲜重(g)。

这是我当时做的芽的实验方法,通用的