关于考马斯亮蓝法测定蛋白质标准曲线如下:
一、试剂:
1.考马斯亮蓝试剂:
考马斯亮蓝G一250100mg溶于50ml95%乙醇,加入100ml85%H;PO4,加蒸馏水稀释至 1000ml滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250.4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)HPO4。
2.标准蛋白质溶液:
纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
二、器材:
722S型分光光度计使用及原理,移液管使用
三、标准曲线制作:
1.以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20ug、40ug、50ug、60ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
2.利用标准曲线查出回归方程。
3.用公式计算回归方程。
4.或用origin作图,测出回归线性方程。即A595m-aXX()+6一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上。
5.绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。
四、蛋白质含量的测定:
样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm’然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595m值在0.1-0.05之间,所以上述样品如果A595m值太大,可以稀释后再测As95mm值,然后再计算。
五、注意事项:
1.玻璃仪器要洗涤干净。
2.取量要准确。
3.玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
4.对照:用被测物质以外的物质作空白对照。