人工海藻糖酶多肽片段的合成与重组海藻糖酶的制备
国外采用标准9一甲氧羰基荧光素固相合成法合成氨基酸残基序列291～307肽段(SKDVEIADT[~PEGDREA)。此合成过程通过反相高效液相色谱法(HPLC)进行分析与提纯，HPLC根据分子的亲水性与电荷的差异进行样品分离。反相HPLC的优点在于高分辨率，分子生物学方法表达出的重组人海藻糖酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离纯化后，可用于免疫原。
抗海藻糖酶单克隆抗体的制备
通过腹腔注射加佐剂的重组蛋白或合成的多肽，免疫8周龄的雌性小鼠BALB/c，进行多次注射后，通过改良的Kohler和Milstein方法，将脾细胞与B细胞瘤株P3一X63一Ag8融合。最终产生了8种杂交瘤克隆株：KM2275、KM2276、KM2285～2290。其中，单克隆抗体KM2275和KM2276是由重组海藻糖酶免疫产生的抗体，其余抗体则是由合成多肽免疫产生的。抗体KM2275和KM2287能够与重组海藻糖酶和尿液中的海藻糖酶良好反应。
夹心EI,ISA方法的建立
此方法使用单克隆抗体KM2287包被ELISA反应板小孔，生物素标记单克隆抗体KM2275，以及HRP标记链霉亲和素，采用生物素一亲和素夹心酶免疫测定。通过实验确定了该方法的最适工作条件：尿液标本需经凝胶过滤，过滤后的尿液需用含1g/LSDS的PBS稀释10倍，最适pH范围为6.0～8.0。尿液在-60℃、-30℃或4℃下保存30天，酶蛋白含量未见下降。维生素C、葡萄糖、白蛋白与肌酐等可能影响物质均未对ELISA方法产生影响。
扩展资料
海藻糖酶一种催化海藻糖水解的酶，在工业和医学方面有重要作用．
