线粒体呼吸测定仪的工作原理基于电解过程。当在氧电极的两极之间施加电压，且超过氧气的分解电压（大约-0.2V）时，氧气会在铂阴极上发生还原反应：O2 + 2H2 + 4e = 4OH。相反，在银阳极上，银会经历氧化反应：4Ag + 4Cl = 4AgCl + 4e。这个过程导致电极间产生电解电流，因为氧在阴极被还原，造成阴极表面氧浓度降低，溶液中的溶解氧会向阴极扩散来维持还原反应的进行。然而，由于电极反应速度极快，而氧分子扩散较慢，电解电流的大小受到氧扩散速度的限制，这部分电流被称为扩散电流。
在溶液静止、温度恒定的条件下，扩散电流受被测溶液中氧的浓度与电极表面氧浓度差的影响。当外加电压增加，电极表面的氧浓度降低，两者浓度差增大，扩散电流也随之增加。然而，当极化电压达到一定值时，阴极表面的氧还原速率超过了扩散速率，氧浓度接近于零。此时，扩散电流主要由被测溶液中氧的浓度决定，对极化电压的微小变化基本不敏感。在0.6～0.9V的极化电压范围内，氧电极输出的电流与电极外部氧浓度之间呈现出良好的线性关系。
因此，在恒定的极化电压和温度下，扩散电流的大小可以作为溶解氧定量测定的基础。通过电极控制器的电路，将扩散电流信号转化为电压输出，再通过自动记录仪记录数据。这种方法为线粒体呼吸测定提供了可靠的定量依据。
