其原理为：由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。具体试验方法有：①糖类发酵试验是鉴定细菌最常用的生化反应，特别是对肠杆菌的鉴定尤为重要②葡萄糖代谢类型鉴别试验③七叶苷水解试验④淀粉水解试验⑤甲基红试验⑥V-P试验⑦β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）。
1.糖（醇、苷）类发酵试验
（1）原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，有的能分解多种糖类，有的仅能分解l～2种糖类，还有的不能分解。细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。
（2）培养基：在培养基中加入0.5％～1％的糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇、肌醇等）、苷类（水杨苷等）。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。
（3）方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培养基中，置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应保持湿度，以免培养基干燥。
（4）结果：接种的细菌，若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。
（5）应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。
2.氧化-发酵试验（0/F试验）
（1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。
（2）培养基HL：Hugh-Leifson培养基。
（3）方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于lcm.将培养基于35℃培养48h或更长。
（4）结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型两支培养基均产酸为发酵型若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。
（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。
3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
（1）原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下也可检出。
（2）试剂：0.75MONPG溶液：取80mg溶于l5ml蒸馏水中，在加入缓冲液（6.9gNaH2P04溶于45ml蒸馏水中，用30％NaOH调整pH为7.0，再加水至50m1）5ml，置4℃冰箱中保存。0NPG溶液为无色，如出现黄色，则不应再用。
（3）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5min，加入0.25mlONPG试剂，水浴20min～3h观察结果。
（4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。
（5）应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。
4.七叶苷水解试验
（1）原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的二价铁离于反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。
（2）培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。
（3）方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。
（4）结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。
（5）应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。
5.甲基红试验
（1）原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。
（2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。
（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2～4d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。
（4）结果：呈现红色为阳性橘红色为弱阳性黄色为阴性。
（5）应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。
6.V-P试验
（1）原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，被空气中的氧氧化为二乙酰，进而与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，则为V-P试验阳性。若培养基中胍基含量较少，则可加入少量含胍基化合物，如肌酸或肌酐等。试验时加入a-萘酚可加速此反应。
（2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。
（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养48h后加入甲液（6％α-萘酚酒精溶液）和乙液（40％KOH溶液），振摇。
（4）结果：在数分钟内出现红色为阳性如无红色出现且于35℃4h后仍如故者即为阴性。
（5）应用：本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。
